ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENITRIFIKASI

DARI 14 SAMPEL TANAH DI KABUPATEN BOGOR

Thesis

YULY RATNA PRATIWI.

Dibimbing oleh :

Prof.DR. Ir. ISWANDI ANAS. MSc*, DR. RAHAYU WIDYASTUTI, MSc, dan Dra. ROSMIMIK, MSi**

*) Disamping sebagai seorang Guru Besar, beliau adalah juga

Konsultan Utama CV.MARROS LESTARI

**). Disamping sebagai seorang peneliti di Lembaga Penelitian Pertanian ,

beliau adalah juga Tenaga Ahli CV.MARROS LESTARI.

Silahkan lihat Company Profile CV.MARRSOS LESTARI di :

http://ifile.it/o46ljqx/CV-MARROS%20PROFILE-2011v1.pdf

RINGKASAN

Limbah berupa limbah domestik maupun limbah cair industri yang umumnya dibuang ke kawasan perairan. Limbah tersebut mengandung berbagai unsur kimiawi, diantaranya adalah amonium (NH₄⁺). Amonium merupakan senyawa nitrogen yang pada kadar tinggi bersifat racun. Salah satu metode yang digunakan untuk mengatasi akumulasi amonium ini yaitu proses nitrifikasi. Proses ini dilakukan dengan menggunakan bantuan aktivitas bakteri penitrifikasi. Bakteri penitrifikasi yang umum digunakan adalah bakteri penitrifikasi yang berasal dari genus Nitrosomonas sp. dan Nitrobacter sp. Bakteri Genus Nitrosomonas sp. merupakan bakteri yang mampu mengoksidasi amonium menjadi nitrit, sedangkan Nitrobacter sp. mampu mengoksidasi nitrit tersebut menjadi nitrat.

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi terhadap bakteri pengoksidasi amonium (Nitrosomonas sp.) dan bakteri pengoksidasi nitrit (Nitrobacter sp.) dengan menggunakan media spesifik untuk masing-masing bakteri, serta melakukan seleksi kemampuan bakteri tersebut dalam menurunkan konsentrasi amonium dan meningkatkan konsentrasi nitrat. Bahan yang digunakan adalah sampel tanah yang berada di sekitar kandang ternak (sapi, kerbau, kambing, dan ayam) sebagai sumber mikroba penitrifikasi dari 14 lokasi di Kabupaten Bogor. Isolasi kedua kelompok bakteri tersebut dilakukan dengan metode enrichment culture dengan menggunakan media spesifik yang dikembangkan oleh Verstraete (1981, dalam Iswandi, 1989) dengan tiga taraf konsentrasi (NH₄)₂SO₄, yaitu 250 ppm, 500 ppm, dan 1000 ppm (NH₄)₂SO₄. Penetapan konsentrasi amonium dan nitrat dilakukan dengan menggunakan Spectrophotometer.

Aktivitas bakteri penitrifikasi paling optimum terjadi pada media spesifik dengan taraf konsentrasi 500 ppm (NH₄)₂SO₄dan pada hari ke-4 setelah inkubasi. Isolat “Nitrosomonas” yang mampu menurunkan konsentrasi amonium dengan cepat pada konsentrasi tersebut secara berurutan dari yang paling cepat adalah isolat NSsp1, NSkm1, NSkm2, NSkm3, dan NSsp3, sedangkan isolat “Nitrobacter” yang paling cepat meningkatkan konsentrasi nitrat secara berurutan dari yang paling cepat adalah NBsp1, NBkb1, NBam, NBsp5, dan NBkm4. Isolat-isolat tersebut kemudian dipasangkan sehingga diperoleh 25 pasang isolat yang juga ditetapkan kemampuannya dalam menurunkan konsentrasi amonium sekaligus meningkatkan konsentrasi nitrat. Berdasarkan hasil penetapan, diperoleh 5 pasangan isolat yang memiliki kemampuan paling cepat dalam menurunkan konsentrasi amonium dan meningkatkan konsentrasi nitrat adalah pasangan isolat NSsp1-NBsp5, NSsp1-NBkm4, NSkm2-NBkb1, NSkm3-NBkb1, dan NSsp3-NBsp5.

Kata Kunci: Nitrifikasi, Bakteri Penitrifikasi, Bakteri Pengoksidasi Amonium, Bakteri Pengoksidasi Nitrit

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Nitrifikasi

Definisi nitrifikasi di dalam tanah secara umum adalah pengubahan nitrogen secara biologis di dalam tanah dari bentuk tereduksi menjadi bentuk yang lebih teroksidasi atau dengan kata lain oksidasi biologis garam amonium dalam tanah menjadi nitrit dan selanjutnya oksidasi nitrit menjadi nitrat (Rao, 1994).

Oksidasi amonia ke nitrat dapat diselesaikan dengan 3 bentuk proses, yaitu proses kimiawi (chemical), proses physicochemical, dan proses biologis (biological chemical) yang merupakan proses yang amat penting. Mengenai proses biologis dari amonia menjadi nitrat sesungguhnya berlangsung melalui 2 tingkatan, yang selanjutnya dikenal sebagai proses nitritasi dan nitratasi (Sutedjo et al., 1991).

Menurut Spotte (1979), nitrifikasi adalah proses oksidasi amonia menjadi nitrit dan kemudian menjadi nitrat secara biologis oleh bakteri autotrof, umumnya berasal dari genus Nitrosomonas sp. dan Nitrobacter sp. yang merupakan genus yang terpenting dari bakteri autotrof. Bakteri autotrof yang melakukan proses nitrifikasi membutuhkan senyawa anorganik sebagai sumber energi dan karbondioksida sebagai sumber karbon.

Nitrifikasi melalui dua tahapan reaksi, yaitu tahap pertama oksidasi amonium menjadi nitrit yang dilakukan oleh mikroba pengoksidasi amonium (Nitrosomonas sp.), pada tahap kedua oksidasi nitrit menjadi nitrat oleh mikroba pengoksidasi nitrit (Nitrobacter sp.).

Dinamika Nitrogen-Nitrobacter-Nitrosomonas

Faktor-faktor yang mempengaruhi proses nitrifikasi adalah jumlah NH₄⁺ dalam tanah, populasi mikrob, reaksi tanah, aerasi tanah, kelembaban tanah, dan temperatur. Amonium (NH₄⁺) dapat berasal dari proses dekomposisi bahan organik. Apabila perbandingan C/N dari satu bahan organik tinggi, maka NH₄⁺ yang dihasilkan dari proses dekomposisi akan sebanding dengan pertambahan populasi mikroba Penelitian-penelitian yang dilakukan Universitas Iowa membuktikan bahwa apabila faktor-faktor yang berpengaruh terhadap proses nitrifikasi pada dua tempat yang sama, proses tersebut tetap terhambat jalannya. Ternyata hambatan ini disebabkan oleh populasi mikroba yang berbeda di kedua tempat. Proses nitrifikasi biasanya berlangsung antara pH 5.5 sampai pH 10 dengan pH optimum sekitar 8.5, tetapi juga diketahui bahwa nitrat dapat dihasilkan pada tanah dengan pH 4.5 dan terdapat laporan bahwa proses nitrifikasi terjadi pada padang rumput dengan pH 3.8. Nitrifikasi berlangsung lebih lambat dibandingkan dengan pupuk amonium sebab ada pengaruh NH₃ bebas terhadap kegiatan mikroorganisme (Leiwakabessy et al., 2003).

Sedangkan menurut Paul dan Clark (1996); Jenie dan Rahayu (2004), faktor-faktor yang mempengaruhi nitrifikasi antara lain (1) kemasaman, nilai pH maksimum berkisar dari 6.6 sampai 8.0. Tingkat nitrifikasi dalam tanah pertanian di bawah pH 6.0 dan menjadi lebih rendah di bawah 4.5. Nilai pH yang tinggi menghambat transformasi NO₂^- ke NO₃^-; (2) aerasi, karena O₂ merupakan kebutuhan obligat bagi semua spesies, maka aerasi penting bagi nitrifikasi. Difusi O₂ ke dalam tanah dan untuk aerasi dikendalikan oleh faktor-faktor seperti struktur dan kelembaban tanah; (3) Kelembaban dan temperatur, kelembaban mempengaruhi regim aerasi dalam tanah. Kadar air tanah berpengaruh dalam produksi NO₃^-. Kelembaban optimum bervariasi untuk tanah-tanah berbeda, tapi kebanyakan nitrifikasi berlangsung pada kelembaban -0.1 sampai -1 MPa. Reaksi mineralisasi secara umum menghasilkan NH₄⁺ lebih rendah jika dibandingkan saat kekurangan air atau temperatur rendah; NH₄⁺ terakumulasi dalam kadar air rendah atau tanah yang beku. Meskipun nitrifikasi berjalan lambat di bawah 5^oC, namun dapat berlangsung pada tanah-tanah yang tertutup salju. Nitrifikasi juga berjalan lambat pada suhu di bawah 40^oC. Suhu optimumnya antara 30 dan 35^oC. Hubungan antara temperatur, kelembaban, aerasi, dan faktor lainnya membuat efek musim. Di daerah beriklim sedang, nitrifikasi terjadi sangat cepat saat musim semi dan gugur, dan paling lambat terjadi saat musim panas dan dingin.

Faktor-faktor lain yang mempengaruhi proses nitrifikasi adalah waktu tinggal sel rata-rata (mean cell residence time/MCRT), laju hidraulik, tingkat kompetisi dengan bakteri (nitrifikasi) heterotrof, Rasio AOB/NOB, dan konsentrasi senyawa toksik/penghambat proses nitrifikasi seperti aseton, fenol, etilendiamin, kloroform, heksametilendiamin, etanol, seng, tembaga, air raksa, krom, nikel, perak, kobalt, kadmium, dan logam berat lainnya (Magdalena, 2009). Nitrifikasi tidak hanya berperan dalam ketersediaan N, akan tetapi juga berpotensi mencemari air tanah lewat pelindian NO₃^- (nitrat) karena kemampuan tanah menjerap anion pada umumnya kecil dan mencemari tanah oleh NO₂^- yang beracun bagi tumbuhan. Untunglah konversi nitrit ke nitrat berlangsung lebih cepat daripada konversi amonia ke nitrit (Notohadiprawiro, 1999).

Nitrifikasi dapat pula menyebabkan kerugian. Amonium merupakan kation, diadsorbsi oleh tanah, dan relatif stasioner. Di sisi lain, nitrat adalah anion yang mobil di dalam larutan tanah. Di bawah kondisi tertentu, khususnya pada tanah berpasir dengan curah hujan tinggi atau irigasi berlebihan dilakukan, NO₃^- akan tercuci dari daerah perakaran. Hal tersebut juga dapat terjadi akibat kehilangan dalam denitrifikasi. Hal ini dapat mengkontaminasi atmosfer. Pencucian kelebihan NO₃^- dari tanah seringkali berakhir dalam air bawah tanah, danau, dan sungai. Hal ini dapat berimplikasi pada: (1) kelebihan pertumbuhan tanaman dan alga (eutrofikasi), (2) masalah kesehatan seperti methemoglobin hewan, (3) terbentuknya nitrosamin yang bersifat karsinogen akibat adanya reaksi dengan senyawa nitrogen lainnya. Gas intermediet hasil nitrifikasi merupakan polutan atmosfer (Paul dan Clark, 1996).

Produk samping atau gas intermediet dari reaksi oksidasi amonium dapat berupa gas N₂O atau dapat juga digunakan sebagai senyawa nitrogen yang terlibat dalam metabolisme bakteri pengoksidasi amonium setelah diasimilasi oleh sel (Tresnawati, 2006). King dan Nedwell (1985) menjelaskan bahwa produksi N₂O meningkat secara proporsional dengan menurunnya konsentrasi amonium karena proses oksidasi.

2.2. Bakteri Penitrifikasi

Bakteri penitrifikasi termasuk ke dalam dua kelompok fisiologi yang berbeda, yang terpenting dari masing-masing kelompok adalah Nitrosomonas yang mengoksidasi amonium menjadi nitrit dan Nitrobacter yang mengoksidasi nitrit menjadi nitrat. Kedua macam bakteri itu berbentuk batang kecil, Gram negatif, tidak membentuk endospora, berflagella polar, dan bersifat aerob obligat (Imas et al., 1989). Nitrosomonas dan Nitrobacter lebih menjadi perhatian karena adanya pendapat yang menginginkan agar proses nitrifikasi ini perlu dikendalikan sehubungan dengan efisiensi pemupukan N dan pengendalian pencemaran lingkungan (Iswandi, 1989). Bakteri pengoksidasi amonia tergolong Gram negatif yang memiliki bentuk sel batang (panjang 0.6-4 µm), ellipsoid, sferikal, dan spiral. Sel tidak motil dan motil dengan flagella polar sampai subpolar atau peritrik. Semua spesies aktivitasnya berjalan pada kondisi aerobik, temperatur pertumbuhan optimum 25-30^oC, tidak aktif pada suhu 4^oC dan pH optimum berkisar 7.5-8.0. berkoloni pada media seperti kerikil, pasir, atau media sintetik lain, memerlukan oksigen untuk mengkonversi senyawa anorganik sebagai sumber energinya, dan memerlukan CO₂ sebagai sumber karbon. Rasio reproduksi sangat lambat (waktu generasi 20-40 jam) (Holt et al., 1994; Magdalena, 2009).

Bakteri nitrifikasi tumbuh sangat lambat meskipun pada kondisi optimum. Waktu generasinya bergantung pada pH dan bervariasi dari 100 jam pada pH 6.2 sampai 38 jam pada pH 7.6 bagi Nitrosomonas dan dari 58 jam pada pH 6.2 sampai 21 jam pada pH 6.6 atau lebih bagi Nitrobacter. Waktu generasi ini dihitung dari laju pengubahan nitrogen amonium dan nitrogen nitrit dan dengan anggapan bahwa hubungan antara waktu generasi dan hilangnya substrat di dalam tanah itu seperti yang terjadi pada biakan (Imas et al., 1989). Menurut Alexander (1999), Nitrosomonas dan Nitrobacter tergolong ke dalam bakteri kemoautotrof obligat. Kemoautotrof obligat memerlukan sumber energi yang spesifik, misalnya saja Nitrosomonas membutuhkan amonium sebagai sumber energi dan Nitrobacter memerlukan nitrit. Akan tetapi, menurut laporan, Nitrobacter dapat menggunakan asetat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi, sehingga sebenarnya istilah ‘autotrof fakultatif’ mungkin lebih sesuai (Imas et al., 1989).

2.2.1. Bakteri Pengoksidasi Amonium

Bakteri-bakteri yang tergolong ke dalam bakteri pengoksidasi amonium antara lain bakteri yang berasal dari Genus Nitrosomonas. Bakteri yang tergolong ke dalam Genus Nitrosomonas adalah Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas oligotropha, dan Nitrosomonas ureae. Selain dari Genus Nitrosomonas, bakteri pengoksidasi amonium yang lain berasal dari Genus Nitrosococcus (Nitrosococcus briensis, Nitrosococcus oceani), Genus Nitrosospira (Nitrosospira briensis, Nitrosospira multiformis, Nitrosospira tenuis), Genus Nitrosolobus (Nitrosolobus multiformis), dan Genus Nitrosovibrio (Nitrosovibrio tenius) (Magdalena, 2009). Bakteri-bakteri tersebut menurut Holt et al. (1994) termasuk ke dalam genus bakteri pengoksidasi amonium dan bersifat obligat kemoliautotrof yang membutuhkan energi untuk mengoksidasi amonium atau nitrit menjadi nitrat. Kebutuhan sumber karbon diambil melalui proses fiksasi CO₂. Spesies bakteri pengoksidasi amonium ini terdistribusi mulai dari tanah, laut, danau, sungai, dan sistem pembuangan limbah. Nitrosomonas sp. adalah bakteri aerob khemolitotrof obligat yang memperoleh energi dari oksidasi senyawa amonium dan menggunakan CO₂ sebagai sumber utama karbon di dalam sintesa biomassanya. Secara morfologis, bakteri ini berbentuk batang pendek, kadang-kadang bentuk sel elips, motil dan non motil, terdapat dalam bentuk konsorsium, berpasangan sebagai rantai pendek maupun sendiri. Bakteri ini adalah bakteri Gram negatif dan memiliki sitomembran. Sel tumbuh bebas pada medium dan membentuk matriks tipis. Bakteri ini dapat tumbuh optimum pada temperatur 5-30^oC dan pH optimum 5.8-8.5, serta hidup pada habitat air laut, air tawar, dan tanah (Holt et al., 1994; Hairiyah dan Handayanto, 2007). Jenis Nitrosococcus sp. bentuk selnya sferik sampai ellipsoidal, Gram negatif, bersifat motil dengan satu atau dua flagella, mampu tumbuh pada suhu sekitar 15-30^oC dengan pH 6.5-8.0, dan habitatnya di air tawar atau air laut. Bakteri yang berasal dari Genus Nitrospira sp. bentuk selnya spiral, Gram negatif, mempunyai sitomembran yang tidak merata, kadang-kadang membentuk seperti membran plasma, non motil dan motil dengan menggunakan flagella peritrikus, dan memiliki habitat di air tawar (Holt et al., 1994).

2.2.2. Bakteri Pengoksidasi Nitrit

Salah satu bakteri yang berperan dalam mengoksidasi nitrit menjadi nitrat berasal dari genus Nitrobacter. Genus Nitrobacter ini terdiri atas Nitrobacter alakticus, Nitrobacter hamburgensis, Nitrobacter vulgaris, dan Nitrobacter winogradsky. Nitrobacter sp. diketahui dapat mengoksidasi nitrit oksida (NO) menjadi nitrat (NO₃^-), kebutuhan sumber karbon diambil melalui proses fiksasi CO₂. Habitat kelompok bakteri ini tersebar pada air tawar, air laut, serta tanah. Jenis Nitrobacter sp. selnya berbentuk batang pendek, pleomorfik, seringkali berbentuk pears, Gram negatif, dan biasanya non motil (Holt et al., 1994). Selain genus Nitrobacter, genus lain yang mampu mengoksidasi nitrit adalah genus Nitrococcus (Nitrococcus mobilis merupakan satu-satunya spesies yang termasuk Nitrococcus yang dijumpai hanya di perairan laut), genus Nitrospina (Nitrospina gracilis), dan Nitrospira (Magdalena, 2009). Oleh karena Nitrobacter adalah bakteri autotrof maka proses nitrifikasi hanya berlangsung bila ada oksigen. Makin tinggi kadar oksigen makin tinggi pula laju proses nitrifikasi. Pada suasana anaerob proses ini akan terhambat. Pada pH yang terlalu tinggi (pH 7.5-8.0) aktivitas bakteri Nitrobacter berkurang sehingga terjadi penumpukan NO₂^- karena konversi ke NO₃^- tertekan. Tetapi sebaliknya pada pH 7.0 kecepatan konversi NO₂^- ke NO₃^- melebihi kecepatan konversi NH₄⁺ ke NO₃^- (Leiwakabessy et al., 2003). Jenis Nitrospina sp. bentuk selnya batang panjang, Gram negatif, bersifat non motil, memiliki habitat di air laut, dan tumbuh baik pada kondisi lingkungan yang mengandung senyawa organik. Suhu optimum untuk pertumbuhannya berkisar 25-30 ^oC dan pH 7.5-8.0 (Holt et al., 1994).